【YTR-009】本当に来てくれたOLさん 4時間 卵白质褂讪性、半衰期实验的旨趣、智力和诳骗
卵白质降解速率和半衰期的推敲关于了解卵白质功能、劝诱调遣疾病特异性卵白质降解的药物以及推敲调遣卵白质水平的小分子化合物具有要紧好奇。卵白质品貌的调遣关于守护相通的细胞功能至关要紧【YTR-009】本当に来てくれたOLさん 4時間，细胞中的扫数卵白质齐在不停被降解和替换。
真核细胞有两种主要的卵白质降解阶梯——泛素-卵白酶体阶梯和自噬-溶酶体阶梯。其他具体的降解阶梯不错阅读往期著述：《5种卵白质降解阶梯你齐了解吗？》
泛素-卵白酶体阶梯是细胞中卵白质降解的主要阶梯，参与多样卵白质的降解。它以一种特定的、高度复杂的机制降解细胞中的卵白质，况兼不错通往常泛素化酶来逆转。自噬-溶酶体阶梯是一种自我降解流程，它通过溶酶体介导降解卵白质，通过包被卵白质并变成自噬溶酶体来得志细胞的代谢需求。这两种阶梯在守护细胞相通的卵白质代谢中齐起着至关要紧的作用，卵白质的很是降解可能导致好多疾病，尤其是神经退行性疾病和癌症。
卵白质的半衰期变化很大，从几分钟到几天不等，卵白质降解速率的不同对卵白质功能很要紧。常用的检测卵白质褂讪性的智力包括：
（1）脉冲跟踪测定；（2）质谱时刻；（3）CuAAC（铜催化叠氮化物-炔烃环加成物）鲜艳法；（4）卵白质降解阶梯扼制剂；（5）CHX（环己酰亚胺）法。
（1）脉冲跟踪测定法是基于将辐射性核素鲜艳的氨基酸（举例S35鲜艳的蛋氨酸）添加到细胞培养基中，进而细胞中特定卵白质的变化流程不错通过免疫陈迹或其他智力检测。操办词，这种智力使用同位素，对推敲东谈主员的健康和安全有一定的负面影响，操作流程复杂。
（2）频年来，质谱时刻照旧发展到检测卵白质一级结构的降解。因此，通过质谱法检测卵白质降解可用于推敲卵白质结构，功能和质地为止。
（3）此外，据报谈，CuAAC（铜催化叠氮化物-炔烃环加成物）可用于鲜艳细胞中新合成的卵白质，因而可用于推敲卵白质降解。
（4）卵白质降解推敲还不错通过添加扼制剂来推敲细胞降解阶梯。举例，卵白酶体扼制剂如MG-132、环氧霉素和硼替佐米通过阻断通过泛素-卵白酶体阶梯来扼制卵白质降解。氯喹和巴弗洛霉素A1等扼制剂通过中庸溶酶体中的酸性 pH值起作用，因为pH值是溶酶体卵白酶功能所必需的，因此氯喹和巴弗洛霉素A1大致扼制溶酶体阶梯介导的卵白质降解。
（5）推敲卵白质褂讪性的最常用智力是卵白质翻译防碍剂环己酰亚胺（CHX）。
CHX简介：CHX是灰链霉菌的家具，可用于细目分子生物学中卵白质或酶的半衰期。CHX是一种翻译扼制剂，不错阻断真核核糖体易位流程。值得提防的是，CHX不错扼制真核卵白合成但弗成扼制原核卵白质合成。CHX的优点是易于操作，不需要研讨正在进行的卵白质合成的影响，况兼不错进行高通量筛选。另一方面它的主要瑕疵是 i） 在莫得特异性的情况下阻断扫数卵白质翻译，以及 ii） 具有高细胞毒性，恒久贬责后可引起大范围细胞升天，故不适用于降解速率较慢的卵白质。因此，需要把柄合适的条目采选CHX。
欧美萝莉CHX使用智力：简便来说便是用合乎浓度的CHX贬责细胞（相通为100μg/mL），贬责不同时间点收罗细胞进行WB实验检测跟着贬责时期的延迟，卵白质水平的变化。
遵循分析：半衰期短的卵白质会跟着时期的推移马上降解，而半衰期长的卵白质跟着时期的推移，降解的很少。因此，CHX不错在不使用辐射性同位素的情况下灵验地可视化卵白质降解的速率。
案例分析：不才面这个案例中，用50μg/mL的CHX贬责6h和12h，WB检测卵白抒发，发现敲低AHI1加快了Tyk2的卵白质降解。需要提防的是，内参卵白Tublin相比褂讪，是以即便CHX贬责12h，Tublin也莫得昭彰的降解。
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敲低AHI1加快了Tyk2的卵白质降解（Ying Miao et al. 2023. bio protocol）
需要提防的是，卵白质的降解速率互相之间各别很大。因此，在进行认竟然实验之前，需要先摸索一下盘算卵白质降解的速率。一般提出建设少至5个时期点来检测卵白质的半衰期，以确保不错不雅察到昭彰的卵白质降解的变化趋势。
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